大学实验-工业微生物的筛选和紫外诱变育种一．实验目的：加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。二、实验原理：根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株。三．培养基及仪器：降解亚硝酸盐培养基：NaNO20.2%，KH2PO40.7%，MnSO4.H2O0.25%，Na2HPO41.35%，MgSO4.7H2O0.1%，葡萄糖1％，琼脂2％，0.1MPa灭菌20分钟。6个250ml三角瓶，各装100ml培养基。同时灭菌试管20支，1ml吸管12支，普通平皿60个，灭菌生理盐水。培养亚硝酸盐降解菌发酵液1瓶，每位同学准备1个斜面。3．洁净工作台、培养箱、三角瓶、曲玻棒、平皿。四．操作方法课前半小时打开超净工作台灭菌。1.土壤中降解亚硝酸盐细菌的筛选分离稀释土样。5g土样，加入45ml无菌水中。为10-1，然后取1ml加入9ml无菌水，为稀释10-2，直至稀释至10-8溶化培养基。将溶化后不烫手的培养基倒入平皿，刚好盖过平皿底部，迅速摇匀后放置，使培养基冷却，要求平皿培养基表面平整、光滑。吸取10-4，10-5或10-6相应浓度的土样稀释液0.5ml，加入平皿内，用烧过灭菌的曲玻棒均匀涂平，放入37℃培养箱中倒置培养48小时。 2.亚硝酸盐分解菌的紫外诱变育种取10ml培养好的液体培养液，放入90mm培养皿，将皿放置于诱变箱的磁力搅拌器上,置于30W紫外灯下，照射90s，用无菌生理盐水稀释至10-6，10-7，10-8，按常规方法涂布筛选平板。同学可自行选择培养亚硝酸盐降解菌和诱变菌。每位同学做一个平皿。并标记好稀释度、种类和名字。五、实验进程安排及结果分析（1）第1次实验：稀释土样，倒平板，冷却后进行平板涂布，放入恒温培养箱中；或进行菌种诱变，稀释诱变菌，倒平板，冷却后进行平板涂布，放入恒温培养箱中。然后紧接着进行第二个实验。（2）第二次实验：同学回到实验室中，记录实验结果。培养24-48h后，记录观察到的菌落数量。并对其中2-5个不同菌落进行形态描述。挑取其中1个菌落，接入斜面培养基进行菌种保藏。 实验二雅致放射毛霉发酵生产蛋白酶的培养基确定一、实验目的：掌握微生物斜培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。二、实验原理：筛选微生物最适生长及产物形成的营养条件和培养条件，以确定特定产物发酵的工艺参数。三、仪器及试剂：蔗糖，酵母膏，MgSO4等高压灭菌锅、洁净工作台、恒温振荡培养箱。四、操作方法：1、种子培养基2、产酶培养基确定2.1培养基的配制，各组分别选择以下六种培养基配方：（1）基础培养基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO40.36g，KH2PO40.12g，CaCl20.1g。（第一组）（2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖；（3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉；（4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏；（5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5％。（6）第六组，将基础培养基中去掉MgSO4和CaCl2。2.2培养基灭菌高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。 2.3接种冷却到室温开始接种，接种量10％，然后在在28℃、250r/m的条件下培养至发酵液颜色变深、澄清为止。2.4酶活力测定根据各组测定酶活结果，比较确定适宜培养基组成。（1）定义：1g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活单位，以u/g表示。（2）原理：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。（3）试剂和溶液①三氯乙酸（CCl3.COOH）=0.4mol/L：称取三氯乙酸32.7g，用水溶解并定容至500mL②磷酸缓冲溶液③100ug/mLL—酪氨酸标准溶液④10g/L酪素溶液⑤待测酶液：取1ml发酵液稀释备用。（4）分析步骤①求K值②测定a.先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热5min；b.按下列程序操作：试管A（空白）（第二试管）试管B（酶试样，作三个平行样）（第 三试管）↓↓加酶液2.00mL（移液管2ml）加酶液2.00mL↓（40±0.2℃），2min↓（40±0.2℃），2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）（移液管5ml）加酪素2.00mL（摇匀）↓（40±0.2℃），10min↓（40±0.2℃），10min加酪素2.00mL（摇匀）（移液管2ml）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓↓取出静止10min，过滤（第四试管，小漏斗）取出静止10min，过滤↓↓在275nm波长下，用10mm在275nm波长下，用10mm比色皿测其吸光度比色皿测其吸光度（5）计算（=135）X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E式中X——样品的酶活力（u/g）A——试样溶液的平均吸光度K——吸光常数（K=135）8——反应试剂的总体积（mL）2——吸取酶液2.00mL，以1mL计1/10——反应时间10min，以1min计n——稀释倍数E——紫外法与福林法的换算系数（取0.50）五、实验进程安排及结果分析 （1）第1次实验：配制培养基，灭菌，等待灭菌时进行发酵罐的上罐观察。（2）第2次实验：下摇瓶，测定发酵液中蛋白酶活力，对比各组实验，确定培养基；或从发酵罐上取样，测定发酵液中蛋白酶活力。 实验三雅致放射毛霉5L发酵罐发酵实验一、实验目的：掌握发酵罐的操作技能，学习微生物在发酵罐上发酵的过程和实验方法。二、仪器分光光度计、电热恒温水浴锅、生物发酵智能控制系统。三、试剂1、DNS试剂：取6.3g3,5-二硝基水杨酸（DNS）和262mL2mol/LNaOH溶液加到酒石酸钾钠的热溶液中（192g酒石酸钾钠溶于500mL水中），再加5g重蒸酚和5g亚硫酸钠，搅拌使其溶解，冷却后加水定容至1000mL，保存于棕色瓶中放置7天后使用。2、10g/L酪素溶液3、种子培养基4、产酶培养基四、实验方法1、学习发酵罐的使用方法。2、发酵罐中加入培养基，灭菌。3、接种、培养。4、测定酶活:a.先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热5min；b.按下列程序操作：试管A（空白）（第二试管）试管B（酶试样，作三个平行样）（第 三试管）↓↓加酶液2.00mL（移液管2ml）加酶液2.00mL↓（40±0.2℃），2min↓（40±0.2℃），2min加三氯乙酸4.00mL（摇匀）（移液管5ml）加酪素2.00mL（摇匀）↓（40±0.2℃），10min↓（40±0.2℃），10min加酪素2.00mL（摇匀）（移液管2ml）加三氯乙酸4.00mL（摇匀）↓↓取出静止10min，过滤（第四试管，小漏斗）取出静止10min，过滤↓↓在275nm波长下，用10mm在275nm波长下，用10mm比色皿测其吸光度比色皿测其吸光度（5）计算（=135）X=A×K×8/2×1/10×n×E=2/5×A×K×n×E式中X——样品的酶活力（u/g）A——试样溶液的平均吸光度K——吸光常数（K=135）8——反应试剂的总体积（mL）2——吸取酶液2.00mL，以1mL计1/10——反应时间10min，以1min计n——稀释倍数E——紫外法与福林法的换算系数（取0.50）五、实验进程安排及结果分析 （1）第1次实验：在实验老师准备的已灭菌培养基和罐体的前提下，观察罐上接种。同时熟悉罐的结构及每一部件用途。（2）第2次实验：在下摇瓶测定发酵液中蛋白酶活力的同时，每位同学在发酵罐上取样，测定发酵液中蛋白酶活力。