第六节食源性病原微生物致病机理1、食源性致病菌与食源性疾病2、细菌的致病性和毒力3、宿主的防御机理4、Stepsinsuccessfulinfection,5.Ⅲ型分泌系统(TypeⅢsecretionsystem,T3SS)细菌的分泌系统的发现是近年为细菌致病机制研究的重要进展，其中的Ⅲ型分泌系统与动植物的许多革兰氏阴性病原菌的毒力因子的分泌有关。在病原菌与宿主细胞接触后，这一系统得以启动，具有接触介导的特征。启动后细菌分泌与毒力有关的多种蛋白质，与相应的伴侣蛋白结合，从细菌的胞浆直接进入宿主细胞胞浆，发挥毒性作用。,几个细菌的毒力岛及其特征,Ⅲ型分泌系统的组成与分泌机制Ⅲ型分泌系统的组成通常由30～40kbp大小的基因组编码，以毒力岛的形式存在于细菌的大质粒或染色体。有许多高度保守的主要结构成分，有20种以上的蛋白质组成，在分泌中不同蛋白质发挥各自的功能型系统。Ⅲ型分泌系统的分泌机制是一次性分泌，是信号肽不依赖型的。可分泌几种效应蛋白，蛋白质直接从胞浆送达细胞表面。该系统通常在与宿主细胞接触后启动，且分泌产物能够注入细胞，从而影响宿主细胞信号活动，以利于细菌的入侵。,Ⅲ型分泌系统与细菌致病性的关系其关键作用是通过接触依赖性转运将底物蛋白转运到真核细胞内。缺失了该系统的鼠伤寒沙门菌，不论感染途径如何，都不引起全身性疾病。,Ⅲ型分泌系统的特点是一种多成分分泌系统，在G-细菌中高度保守。关键作用是通过接触依依赖性转运将底物蛋白转运到真核细胞内。其分泌的蛋白质不具有典型的分泌蛋白分泌依赖的sec模式。分泌需要辅助蛋白。分泌蛋白质通过细菌内外两层膜转运到真核细胞内。能够把效应分子直接从胞质输送到细胞表面。温度，盐分等环境因素，可诱导分泌装置和效应分子的合成。许多编码该系统的基因与细菌鞭毛装置基因有一定的同源性。编码该系统的基因通常聚在一起DNA片段较大。,ProteindeliveryintoeukaryoticcellsbytypeIIIsecretionmachines.Vol444,2006,Nature,TypeIIIsecretionmachines与真核宿主长期共存的细菌已经进化形成了特殊的适应能力，从而在这种环境中生存和复制。这些适应中最明显的就是III型分泌系统--一种特别进化形成的可将细菌蛋白输入真核细胞的细胞器官。尽管最早是在少数病原菌中被发现，实际上T3SSs可被许多细菌编码。不仅是细胞器官的组装和蛋白的分泌，而且还存在合作关系，且与致病机理有关。,Theassemblyofaprotein-deliverymachine针状组合体由20多种蛋白组成，是迄今发现的最复杂的细菌蛋白分泌系统。该组合体最早在鼠伤寒沙门菌中发现，后来在多种其他细菌中检测到，被认为是所有T3SSs的核心成分。,针状组合体组装过程模型discretesteps不连续的步骤,Multiplesignalstoensuresubstratespecificity转位酶,革兰氏阴性菌蛋白分泌系统T1SS分泌系统，又称ABC分泌系统由位于内膜的提供蛋白质分泌能量的ABC转位酶、定位在内膜跨过周质的膜融合蛋白(MFP)和外膜蛋白(OMP)等3种功能蛋白组成。大肠杆菌A-溶血素分泌系统该系统所分泌的蛋白直接从胞质到达细菌表面,仅有HlyB、HlyD、TolC三种蛋白参与。其中HlyB、HlyD是位于内膜上的特异组成成分,TolC是位于外膜上形成通用孔道的多系统通用成分。,T2SS广泛存在于G-菌中,向细胞外分泌各种蛋白，包括胞外酶、蛋白酶、毒素和毒性因子，这些胞外蛋白毒性因子通常破坏寄主细胞，引起组织坏死和病害。分泌元件主要包括:一系列的内膜蛋白(SecD、SecF和SecY),一个为跨膜提供能量的胞内附膜蛋白ATPase(SecA),一个和分泌蛋白相结合的分子伴侣(SecB),以及周质中的信号肽切除酶。,T4SS是接触依赖性分泌系统，该系统转运的都是一些大分子物质,如核蛋白颗粒、含多个亚单位的毒素等。该分泌系统是一种自主运输系统，其分泌的蛋白需切割、加工，而后形成一个孔道使自身穿出外膜。,T5SS系统所分泌的蛋白质首先通过Sec依赖的分泌通路跨内膜转运，到达外周质间隙后，通过自身C端β结构域在外膜上形成一个β折叠桶，从而实现跨外膜转运。原蛋白可以从β折叠桶结构域上切割下来或者仍与其相连。自主转运蛋白系统,第七节食源性微生物风险评估,我国食品安全风险评估现状2009-12-8成立第一届国家食品安全风险评估专家委员会食品安全风险评估管理规定（试行）2010-1-212010-4-22北京，“2010年国际食品安全论坛”，卫生部食品安全综合协调与卫生监督局局长苏志：中国拟建食品安全风险评估中心。,风险评估风险评估是WTO和CAC(国际食品法典委员会)强调的用于制定食品安全控制措施的必要技术手段，是政府制定食品安全法规、标准和政策的主要基础，也是实施危险管理措施(如HACCP)的主要依据。WTO的动植物检疫协议(SPS协议)规定在确定各国适当的卫生和植物卫生措施的保护水平时应以危险性评估的结果为主要依据，即必须在风险评估的基础上，制定食品中污染物的限量标准。,食源性微生物安全管理制度TheInternationalCommissiononMicrobiologicalSpecificationsforFoods,ICMSF,微生物风险评估的原理风险评估是食品风险分析(包括风险评估、风险管理和风险信息交流)的基础和核心。四个阶段:危害识别：定性方法危害描述：定性/定量方法暴露评估：定性/定量方法风险描述：定性/定量方法英国型或一体型，法国型或分离型,微生物风险评估的评估方法定性风险评估根据风险的大小，人为地将风险分为低风险、中风险、高风险等类别，以衡量危害对人类影响的大小。定量风险评估对风险的性质和严重程度的评估，根据危害的毒理学特征或感染性、中毒性作用特征，结合其它相关资料，确定污染物(或危害物)的摄入量及其对人体产生不良作用的概率，并对它们之间的关系进行数学描述。预测微生物学和数学模型,风险评估的关键在于收集充分的高质量可用信息(如因摄入被污染食品引发疾病的真实资料、数据,爆发数据和相关流行病学资料，消费者消费方式方面的资料等)，必须达到权威机构如WHO、CAC、美国环境保护局(EPA)、FDA、经济合作与发展组织(OECD)等所认可的最基本数据量，其结果才有意义。,JEMRA对即食食品中的单增的风险评估在食品中微生物的数目从25克无致病菌到每克或每毫升含有1000菌落形成单位(ColonyFormingUnits,CFU)范围内，评估食品中单增导致疾病的严重风险;评估不同易感人群相对于普通群体患严重疾病的风险;评估特定食品中单增导致严重疾病的风险。theJointFAO/WHOExpertMeetingsonMicrobiologicalRiskAssessment,1.危害识别指识别可能产生健康不良效果并且可能存在于某种或某类食品中的生物、化学和物理因素。对于微生物因素：识别食品中的微生物有机体或微生物毒素及其与人体健康危害的关系。分析类型应包括传染率(无明显病状)、发病率和死亡率。,危害识别的内容①微生物的基本性状;②作为危害暴露结果的由微生物所致的食源性疾病的资料;③疾病的易感人群以及传播方式;④暴发数据和相关流行病学资料;⑤与食品相关的资料：简要描述何种食品中可存在此微生物，典型危害水平。,RiskassessmentofListeriamonocytogenesinready-to-eatfoods.Website:http://www.fao.org/es/esnAustralianRiskAssessmentmodelforListeriamonocytogenesinready-to-eatmeatshttp://www.foodrisk.org/exclusives/models/AU_listeria.cfm,HazardidentificationIdentifiesknownorpotentialhealtheffectsassociatedwithL.monocytogenesbyestablishingthegeneralrelationshipbetweenthepathogen,itspresenceinfoods,andtheadverseoutcome(illnessordeath)associatedwithconsumptionofcontaminatedfoods.,PopulationGroupsEvaluatedPerinatal:Theperinatalgroupincludesfetusesandneonatesfrom16weeksafterfertilizationto30dayspostpartum.Elderly:Individualswhowere60ormoreyearsofage.Intermediate-agegroup:bothhealthyindividualsandcertainsusceptiblesubpopulationgroups,suchasAIDSpatientsorindividualstakingdrugsthatsuppresstheimmunesystems).在欧盟，55.6%的李斯特菌病患者大于65岁。以前，感染此病的人大多是孕妇，但现在主要是传染老年人中免疫力低下的人群。在美国，88%患病与怀孕无关，71%的患者年龄大于44岁，40%的患者年龄大于或等于70岁。,危害识别单核细胞增生李斯特氏菌是李斯特氏菌属7个种中的1个,该菌为G+、兼性厌氧菌,可以在Aw>0.92、pH值4.39～9.4、温度-0.4～45℃、盐浓度≤10%的环境下生长.分布广泛，人和动物粪便中均可能存在该菌。人和多种动物均可是该菌的健康携带者，估计2%～6%的人和动物携带有该菌，因此人或动物粪便污染食物后经口传播是该菌的主要传播途径。但李斯特菌病的暴发和散发病例主要与即食食品有关。李斯特氏病的发病率为每年每百万人2～6例，死亡率20%～30%。,危害识别70℃以上的热处理可以杀灭单增李斯特氏菌。在煮制与包装工序间可能会发生二次污染，在较长时间(如≥35d)的贮藏期内，该菌可在产品表面繁殖,数量增加至产生危害的水平。美国人患李斯特菌病主要是散发（仅5%的病例与疾病暴发有关）。人类李斯特菌病散发及暴发流行病例均表明污染LM的即食食品与运输有关。,危害识别据美国CDC报道，美国每年约有2,500例李斯特菌病例,其中约有20%死亡。1999年，单增引起的致死率在所有食源性致病菌中位居第二位，引起的住院率位居第一位(90%)。在23个欧盟成员国中，2001年有910人患李斯特菌病，2005年1427例，2006年为1583例,是1996年病例数的2.4倍,发病率为0.3/100万,其致死率超过30%，住院率高达91%。澳大利亚:2006年李斯特菌病为59例,发病率为3/100万,与2001-2005年的平均发病率(3.2/100万)相似。日本：每年的病例数为83例,发病率为0.65/100万,,2.危害描述对与食品中可能存在的生物、化学和物理因素有关的健康不良效果性质的定性或定量评价。对生物或物理因素,如数据可得到时，应进行剂量-反应评估。剂量-反应评估的目的是确定某种化学、生物或物理因素的暴露水平(剂量)与相应的健康不良效果的严重程度或发生频度(反应)之间的关系。Estimatestherelationshipbetweentheexposurelevel(dose)andfrequencyofsevereillnessormortality(response).,危害特征描述的内容致病菌的致病性、毒力、传染性、抗生素耐药性;相关食品对致病菌生长、增殖、产毒和感染力的影响;宿主和媒介生物的特性;致病菌造成的疾病和并发症，致病菌引起的免疫反应;剂量-反应关系模型(指数模型、β-泊松模型、韦伯-伽马模型、蒙特卡罗模型)的构建等。,危害描述WHO李斯特氏病其列为1990’s四大食源性致病菌之一；孕妇、婴儿、60岁以上老人和免疫低下的人是易感人群；李斯特氏病轻度症状表现为流感症状，中度表现为胃肠炎、脑膜炎、败血症、流产等，严重的可致死，死亡率可达20%～30%。,危害描述食源性李斯特氏病的发生：偶然的孤立事件：如家庭冰箱的二次污染造成。局部发生：由于加工厂操作不当造成某一批产品残存单增李斯特氏菌，且该批产品在食用前有机会生长繁殖,消费者食用该产品后得病。大面积发生：由于加工设备或环境污染了单增李斯特氏菌，造成该车间或生产线生产的多批产品污染该菌，消费者食用该产品后得病。,剂量反应关系P=1-e-r*N。P表示严重疾病(侵染性李斯特菌病)的概率N代表摄入单增的数量r代表单一细菌导致侵袭性李斯特菌病的概率，是根据美国2001年暴露模型中的食品污染分布以及CDC对李斯特菌病估计病例数倒推而得到的。,HumanSusceptibilityImmunologicalandphysiologicalfactorsinhumansplayaroleindeterminingthesusceptibilitythatmaybefoundthroughoutapopulation.Theprobabilityofdeathisdescribedforthethreedifferentage-basedgroupsofpeople.Asindicatedabove,epidemiologicalinformationisusedtoadjustthedose-responsemodeltofitthenumberoflisteriosisfatalitiesobservedinFoodNetandtodevelopthedose-responsemodelforeachofthesegroups.,VirulenceEpidemiologicalinformationandlaboratorystudiesindicatethatdifferentstrainsofL.monocytogenesvaryintheirabilitytocauseillness.Thisvariabilityinfluencesthenumberoforganismsrequiredtoproduceillnessandpossiblytheseverityofsymptomsofillness.Alargenumberofpotentialhumanvirulencefactorshavebeendescribedthatseemtooccurinessentiallyallofthehumanandenvironmentalisolatesthathavebeenstudied.Datafrommouselethalitystudiesareusedtomodeltherangeofstrainvirulencethatmaybeencountered.,3.暴露评估指对于通过食品的可能摄入和其他有关途径暴露的生物、化学和物理因素的定性或定量评价。微生物因素：对所消费食品中的致病菌的数量或细菌毒素含量以及有关的膳食信息进行评估,给出食品在食用时致病菌的数量或细菌毒素含量的估计值。其污染水平是动态变化的,所以暴露评估应描述从生产到消费的整个过程。预测微生物学是暴露量评估的有用工具。,暴露评估很多种食品都曾导致过零星发生或大规模爆发的食源性李斯特氏病,在这些食品中单增李斯特氏菌的含量约为100～1×109cfu/g;其中即食食品最容易污染。SCVPH在1999年报道动物食品中李斯特菌病发生率是1%～10%。这与其在2005及2006年的报道一致大量分子分型实验已证实食品生产厂的环境是食品污染LM的污染源；温度是影响食品中LM的重要因素之一,FoodConsumptionFoodContaminationPost-RetailGrowthofListeria--“growthmodule”.考虑消费前致病菌生长繁殖的影响因素,如:贮藏温度、贮藏时间、在不同食品中的生长速度(采用预测性模型评估在食品中的生长速度、失活速度及生长限制)等;结合食品消费的数量和频率,将各种因素拟和到模型中,从而获得消费时食品中单增的浓度,以log10CFU/份污染食品的累积概率来表示。,,欧盟2005年LM污染率较高的即食食品是肉（2.7%）及鱼制品（7.5%），其中鱼制品中29%的污染量大于100/g。2006年LM污染最高的即食食品是鱼制品（4.9%），其次是牛肉制品（3.5%）和猪肉制品（2.7%）。少量样品的污染量高于100/g。欧盟委员会2004年和2005年的概要报道中，2%～3%的零售即食蔬菜含有LM，低于1%的样品中含有高于100cfu/g的LM；0.4%的奶油样品被LM污染。,4.风险描述根据危害识别、危害描述和暴露评估，对某一给定人群的已知或潜在健康不良效果的发生可能性和严重程度进行定性或定量的估计，包括与这些评估有关的不确定性的描述。将前面阶段的所有信息结合在一起，提供一个给定人群的合理评价。这种评估可以通过将单个与危害有关的流行病学数据与疾病的普遍性进行比较而得到。,风险特征描述必须回答:影响健康的风险的本质及发生的可能性;哪些个体或人群存在上述风险;不良效应或影响的严重程度。,,‘What-If’Scenarios假设分析方法RefrigeratorTemperatureScenarioStorageTimesScenarioHomerefrigeratorstemperaturesCasesoflisteriosisThepredictednumberreducednormal210545ºForless65669%notexceed41ºF28>98%StoragetimeCasesoflisteriosisThepredictednumberreduced28days22814days19713.6%10days15432.5%,风险描述综合了前3个步骤的资料信息，将暴露评估的结果应用于剂量-反应关系模型，最后用不同人群每百万份食品产生的风险来表示结果，并用每份食品的风险、食品份数来估计特定群体中每年的病例数。评估结果显示，对于消毒牛奶、冰淇淋、发酵肉类和熏鱼，每年每千万人中李斯特菌病病例数分别为9.1、0.012、0.46和0.00066。,其他一些重要结果几乎所有李斯特菌病均因食用了大量病原菌所致。因摄入单增菌致病的概率可以用致病三要素(食品成分、菌种致病力、消费者易感性)来解释。绝大多数的李斯特菌病与食用不符合现行食品限量标准的食品有关，而与标准的严格程度(0.04CFU/g或100CFU/g)无关。防止食品食用时出现重度污染的控制措施,对降低李斯特菌病发病率具有极大作用。对于有利于病原菌生长的食物,更严格地控制温度或限制贮存时间等控制措施,将会减轻因单核细胞增生李斯特菌数量的增加而导致的风险的增加。,QuantitativeMicrobialRiskAssessmentforStaphylococcusaureusandStaphylococcusEnterotoxinAinRawMilkJournalofFoodProtection,72(8)2009,1641–1653,国内的相关研究对牡蛎副溶血弧菌的风险评估对带壳鸡蛋中的沙门菌的定量风险评估对进境冻大马哈鱼溶藻弧菌的风险评估等,存在问题数据不连续数据覆盖的地区少等