第二章　食品微生物基础影响食品微生物生长的因素微生物的不同状态亚致死细胞不可生长的活性微生物孢子及其重要性食品微生物生态学食品微生物的检测及计数方法微生物指示菌类和微生物标准,第一节影响食品微生物生长的因素影响微生物生长的内在因素影响微生物生长的外在因素栅栏技术,1.影响微生物生长的内在因素pH水分活度氧化还原电位营养成分抗微生物成分生物结构,1)pH值pH值抑(杀)菌机制?WhysomeacidophilesshowinduciblepHHomeostasisandtheAcidToleranceResponse,anddowellinlowpHenvironments?pH动态平衡和酸耐受性反应,①pH与微生物生长与发酵②pH与食品③pH抑菌/杀菌机理④pH动态平衡与耐酸响应,微生物的最低、最适和最高pH微生物最低最高最适大肠杆菌4.39.56.0-8.0枯草芽孢杆菌4.58.56.0-7.5酵母2.58.04.0-5.8霉菌1.57.0-11.03.8-6.0最低pH与酸的种类有关，在相同pH值，有机酸较无机酸对微生物之抑制效果更强。细菌、放线菌：适于中性或偏碱的环境酵母、霉菌：适宜偏酸的环境,Variousshapesofμg–pHcurvesSpecificgrowthrateofbacteriaasafunctionofpHtoshowthevariousshapesofμg–pHcurves.pH对微生物生长的影响模型：一种热力学统计方法BIOTECHNOLOGYANDBIOENGINEERING,59(6),1998,微生物生长最适pH与产物形成最适pH相互关系I型发酵较易控制II、III型发酵pH须严格控制IV型应分别严格控制各自的最适pHQpμQpμQpμμQpIIIIIIVI,pH对微生物生长代谢的影响黑曲霉2-2.5利于产柠檬酸2.5-6.5以菌体生长为主7左右以合成草酸为主丙酮丁酸梭菌6.5-7.0以菌体生长为主6.3-6.5进行丙酮丁酸发酵,①pH与微生物生长与发酵②pH与食品③pH抑菌/杀菌机理④pH动态平衡与耐酸响应,各类食品的pH值非酸性食品(pH＞4.5)酸性食品(pH＜4.5)肉类：6.1-7.0牛乳：6.5-6.7蔬菜：6.0-6.8(茄子4.5)水果：柿子6.7苹果2.9-3.3西瓜6.2-6.6葡萄3.4-4.5香蕉4.5-6.7柠檬1.8-2.0桔子3.6-6.3Notethatafood'sacidoralkaline-formingtendencyinthebodyhasnothingtodowiththeactualpHofthefooditself.,AlkalineFoods-AcidicFoodsIfafoodtendstoincreasetheacidityofurineafteritisingested,itisclassifiedasanacidformingfood.Conversely,ifafoodincreasesthealkalinityofurineafterithasbeeningested,itwasclassifieditasanalkalineformingfood.Forexample,orangejuiceisahighlyacidicfoodduetoitshighcitrusacidcontent,butafterbeingmetabolizeditwillcauseurinetobecomealkaline.,HowAlkalineFoodsandpHBalanceAffectYourHealthThehumanbodywasactuallyintendedtoruninaslightlyalkalinestate(7.35-7.45). TheoptimalsalivarypHforsalivais6.4to6.8.WeneedtoeatalkalinefoodstohelprestoretheproperpHbalance.(proteins,cereals,sugars).,微生物生长对食品基质pH的影响发酵过程中pH调节分阶段发酵,①pH与微生物生长与发酵②pH与食品③pH抑菌/杀菌机理④pH动态平衡与耐酸响应,抑(杀)菌机制改变膜电位，影响膜的功能影响代谢过程中酶的活性影响基质中各类物质的性质低pH可使蛋白质变性或菌体表面蛋白质和核酸水解,碱对微生物的作用碱类消毒剂5%-10%石灰乳，2%-3%NaOH消毒对象：环境、工具、设备和冷却池等原理强碱能水解蛋白质和核酸，使微生物的酶系和细胞结构受到破坏分解菌体中的糖类，引进细胞死亡抵抗力：芽孢菌＞G＋＞G－,酸对微生物的作用酸类食品防腐剂乳酸、醋酸、柠檬酸（风味剂）、安息香酸、水杨酸乳酸菌发酵食品、酸渍食品、外加原理：增加H＋浓度，引起菌体表面蛋白(含酶类)变性和核酸水解苯甲酸和水杨酸可与微生物细胞中的成分发生氧化作用，从而抑制微生物的生长影响因素H＋浓度、游离阴离子和未电离的分子本身(有机酸)?温度不同有机酸的杀菌效果不同,RelationshipsbetweenpHandproportionofundissociatedmoleculesofdifferentacids,ExternalconcentrationoforganicacidanionsandpH:keyindependentvariablesforstudyinghoworganicacidsinhibitgrowthofbacteriainmildlyacidicfoodsJFoodSci.2009;74(1):R12-5.,Transmembranepathwaysofundissociatedacidmoleculesanddissociatedprotons/anionsinabacterialcellatacidicandneutralpHlevelsBecause[A-]havetobeactivelypumped,theenergyofthecellisalmostexhaustedforfurtheractivity,thecellhasinsufficientenergyandtimetometabolize[A-]asacarbonsource,andtoalkalinizethepH.,①pH与微生物生长与发酵②pH与食品③pH抑菌/杀菌机理④pH动态平衡与耐酸响应细菌的pH动态平衡质子运输系统ATR系统,按pH动态平衡对细菌分类BacteriaclassifiedbypHhomeostasisTightcontrol如大肠杆菌，胞外pH变化1个单位，胞内可能仅差0.1个单位。Lesstightlycontrol同步变化，但梯度比胞外小如果外部酸性增加，质子流为净进入，则胞内pH会改变，酶会变性，DNA会裂解。,胞内pH的测定方法pH敏感电极法将微电极插入细胞内(破坏细胞膜)核磁共振方法(31P和19F)不损伤细胞的完整性，可以连续的测定并且对一些重要的细胞反应的pH进行动态追踪，精度可达到0.06pH单位。(H2PO-4)的pKa(7.21)接近7，31P谱信号的化学位移随环境pH的改变而变化,嗜酸菌和嗜碱菌嗜酸菌Acidophile保持胞内pH6.0-6.5，有更大的△pH，对弱酸敏感。嗜碱菌Basophile可以pH11条件下生长，胞内pH为7-9，表面蛋白在碱性条件下有活性。,④pH动态平衡与耐酸响应细菌的pH动态平衡质子运输系统ATR系统,质子泵和反向协同运输系统F-type质子泵：是由许多亚基构成的管状结构，H＋沿浓度梯度运动，所释放的能量与ATP合成耦联起来(ATP合酶)。F型质子泵位于细菌质膜，线粒体内膜和叶绿体的类囊体膜上。不仅可以利用质子动力势将ADP转化成ATP，也可利用水解ATP释放的能量转移质子。反向协同物质跨膜运动的方向与离子转移的方向相反，如动物细胞常通过Na+/H+反向协同运输的方式来转运H+以调节细胞内的pH值，即Na+的进入胞内伴随H+的排出。,膜运输蛋白<>Na+/H+葡萄糖/Na+,Structureofthec15ringoftheS.platensisATPsynthase.钝顶螺旋藻naturestructural&molecularbiology,2009,16:1068-74theproton-coupledF1FoATPsynthase,Theringincludes15membrane-embeddedcsubunitsforminganhourglass-shapedassembly.Protontranslocationacrossthemembraneentailsprotonationofaconservedglutamatelocatednearthemembranecenterinthecsubunitouterhelix.F1:水溶性球蛋白,从内膜突出于基质中Fo:嵌合在内膜上的疏水蛋白复合体，形成一个跨膜质子通道。,Proposedmechanismofcoupledrotationandiontranslocationintheproton-dependentF-ATPsynthaseofS.platensisState0:Glu62处于质子锁定构象State1:Glu62将质子释放，细胞质pH8.3State2:去质子的Glu62与带正电的Arg形成盐键，Glu62暂时稳定于去质子构象。State3:从低pH区的另一个质子竞争使Glu62重新质子化，再进入脂质界面。therotormeetsthestator细胞质亲水环境疏水环境,④pH动态平衡与耐酸响应细菌的pH动态平衡质子运输系统ATR系统,InduciblepHHomeostasisandtheAcidToleranceResponseofSalmonellatyphimuriumpHo7.7生长→pHo4.0快速死亡pHo5.8繁殖一代→pHo3.0存活,ATR系统结果：鼠伤寒沙门菌和大肠杆菌的酸耐受反应在pH6.0-5.5时开始触发，可以在pH3.0-4.0时保护细胞，而不能自我平衡适应pH的细胞此时会死亡。ATR系统包括至少18个蛋白(2D-gel)。近来，fur基因产物(铁吸收调节子)被认为有重要的调节功能。,InduciblepHHomeostasisandtheAcidToleranceResponseofSalmonellatyphimuriumpH动态平衡：环境pH在一个较宽的范围内变化，而体内pH能保持相对稳定。原因：质子泵和钾/质子及钠/质子反向协同运输系统共存。控制：变构调节，存在蛋白合成的抑制剂。Nature409,413-416(18Jan.2001),pHi&celldeathEffectsofpHionthepHoofunadaptedcells5.8CelldeathoccurredatpH5.4andbelow2,4-二硝基苯酚无法合成细胞需要的ATP,使得细胞供能不足,细菌死亡是否与蛋白质合成有关？ATR系统有一套预防或修复系统吗？pHi是细胞死亡的直接原因吗？,ProteinsynthesisisrequiredforATR-enhancedhomeostasis.ATRsurvivalbelowpHo4wasshowntorequiredenovoproteinsynthesisEitheranadditionalpHhomeostasissysteminducedduringadaptationoranewprotein(s)thatprotectspreexistinghomeostasismechanisms.,Correlationbetweenviabilityandthemeasurementofacid-damagedprotein.β-半乳糖苷酶可用来监控pHi变化导致的蛋白损伤pH3.3,细菌死亡是否与蛋白质合成有关？ATR系统有一套预防或修复系统吗？pHi是细胞死亡的直接原因吗？,DoestheATRsystemalsoprovidedmechanismsforrepairorpreventionofaciddamage?控制pHi预防或修复？？在pH5.8酸调节和未调节的沙门氏菌细胞调整到pHo5.1然后分别加入400uMDNP或33uMCCCP，用以平衡pHi和pHo。如果酸损伤可被酸调节细胞预防或修复，在质子载体被去除后，酸调节细胞的存活率应比未调节细胞高。结果：pHi(5.3)和存活率均没有区别。结论：在pH5.8酸调节没有诱导出能修复酸损伤的内部系统。休克前期的ATR系统主要是维持pHi进而保持存活率。,细菌死亡是否与蛋白质合成有关？ATR系统有一套预防或修复系统吗？pHi是细胞死亡的直接原因吗？,Screeningforspontaneousacid-tolerantmutants未经酸调节细胞(JF1638orLT，2.2×108)调至pH3.3，至细胞存活数为100-1,000cell/ml。耐酸显型中18%是营养缺陷型。其中44%需要谷氨酸，31%需要尿嘧啶，25%需要其他成分。需要谷氨酸的突变体(icd)缺乏异柠檬酸脱氢酶。另一突变体atr-12需要醋酸盐才能获得最快生长。异柠檬酸脱氢酶并非ATR的主要成分，因此它在酸调节时活性并不会发生改变。？？,pHiordamageacellsurfacecomponent(s)essentialforcellviabilityIcd突变体能积累大量的胞内柠檬酸盐和异柠檬酸盐(40-50mM)。因为这种酸的pKi为6.4，有很强的缓冲能力使pHi趋向这一值，防止其降低到存活临界点pH5.5。pHi--直接还是间接？是否有胞外物变性？增加内部缓冲能力不能防止胞外的酸损伤,短杆菌肽A短杆菌肽A是一种形成通道的离子载体，它具有疏水的侧链，两个分子在一起形成跨膜的通道。它能够有选择地将单价阳离子顺电化学梯度通过膜，可被该离子通道运输的阳离子有∶H+>NH4+>K+>Na+>Li+。,问题鼠伤寒沙门氏菌在酸性环境中pH的动态平衡是依靠什么系统获得的？这个系统有哪些重要的酶？鼠伤寒沙门氏菌在酸性环境中维持pH动态平衡的机制有哪些？,2)水分活度水活度的概念aW=P/POP——一定温度下基质水分所产生的蒸汽压Po——相同温度下纯水的蒸汽压基质水活度渗透压水活度,微生物类群最低aW值范围食品aW大多数细菌0.99-0.94鲜肉0.95-1.00嗜盐性细菌0.75蛋0.97大多数酵母0.94-0.88火腿0.91耐渗透压酵母菌0.66大多数霉菌0.94-0.73干制食品0.8-0.85喜旱真菌0.65奶粉0.20一般食品腐败菌的生长最低aW在0.94-0.99最低aW值范围与温度、氧气、pH及有害物质的存在有关微生物生长的最低aW,渗透压与微生物盐对微生物的抑制机理嗜盐微生物：特异性地需要Na+低等嗜盐细菌(海洋菌，1-3%)、中等嗜盐细菌(3-15%)、高度嗜盐细菌(15-30%)耐盐微生物耐糖微生物,微生物耐渗透压原理在细胞体内积累合适的溶质(盐、多元醇和AA)至一定的浓度，从而防止细胞脱水，甚至从环境中吸收水分。G-：Pro嗜盐细菌：KCl耐盐和耐旱真菌：甘油等多元醇单核细胞增生李斯特菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌：Gly和甜菜碱,SaltStressProteinsInducedinListeriamonocytogenes存活的环境很广：渗透压：10%NaClT：0.1–45℃pH：在pH5.5调节后可低至3.5经常从高盐制品中分离得到，如烟薰鲑鱼。甚至在22℃放置150天的纯盐中还能检测出来。,SaltStressProteinsInducedinListeriamonocytogenes当细菌生存的环境中，一些影响生长或存活的参数发生改变后，会启动新的基因表达程序，一些蛋白会增加或降低表达以应对环境压力。用2-DPAGE检测盐压力下蛋白的表达。在盐压力下有40个蛋白/400-500个的表达被明显诱导或抑制。其中一些蛋白用MS或N-末端序列分析和数据库搜索的方法进行鉴定。12个高诱导表达的蛋白与普通的应力蛋白(Ctc和DnaK)、转运子(GbuA和甘露糖特异的磷酸转移酶IIAB)和普通的代谢蛋白(丙氨酸脱氢酶等)相似。APPLIEDANDENVIRONMENTALMICROBIOLOGY,2002,68(4):1491–1498,3)氧化还原电位(Eh)当电子从一个化合物转移到另一个化合物时，两物质间就产生电势差。物质被氧化得越多，Eh越高，当氧化物和还原物浓度相等时，电势为零。分子态氧影响基质的氧化还原状态。好氧微生物需要正的Eh(被氧化)，其生长繁殖能降低环境中的Eh。食品中有利于维持还原条件的物质：肉中SH基、VC，果蔬中的还原糖等。,食品的Eh和微生物繁殖+820mV-420mV+436mV+409mV+383mV+220～+340mV梨汁葡萄汁柠檬汁奶生碎肉+225mV荷兰干酪-20～-310mV僵硬后肌肉-150mV整粒小麦-320～-360mV+100mV好氧微生物+300～+400mV厌氧微生物兼性厌氧微生物有氧呼吸兼性厌氧微生物无氧呼吸,4)营养成分微生物生长需要的营养物质：水、能源、氮源、维生素及相关的生长因子、矿物质微生物对营养物质的利用简单化合物（AA、单糖等）、大分子（多肽、简单多糖等）、复杂化合物（蛋白质、淀粉、纤维素、油脂）蛋白质（变性）蛋白酶胞外短肽肽酶胞内AA脱氨脱羧有机酸、吲哚、胺H2S、NH3等先简单，后复杂（二次生长现象）,二次生长现象,蛋白质脂肪单糖或双糖有机酸和醇类淀粉、(半)纤维素细菌大多数大多数绝大多数部分少数酵母较弱少数绝大多数大多数极少数真菌大多数，且多强于细菌大多数大多数少数极少数微生物的分解能力,5)抗微生物成分具有抗微生物成分的食品，有较强的抗菌能力部分食品含有具抗菌能力的油鸡蛋、牛乳中的溶菌酶乳免疫球蛋白IgG（牛）、IgA（人）、IgD、IgE、IgM）乳过氧化物酶/SCN-/H2O2体系抑制期→乳链球菌期→乳酸杆菌期→真菌期→胨化菌期外源性的抗微生物成分生物杀菌剂、化学杀菌剂,6)生物结构天然食品自身的外层结构种子的种皮水果的外皮坚果的壳动物的皮毛蛋壳加工食品的外包装有类似作用肠衣、包装袋、瓶罐